Набор для секвенирования ДНК со стадией ПЦР, PCR Seqiencing Kit, Oxford Nanopore Technologies

Набор предназначен для получения сиквенсной библиотеки из геномной ДНК в тех случаях, когда количество стартового материала ограничено. С помощью набора PCR Sequencing Kit можно:

• работать с небольшим исходным количеством ДНК;
• контролировать длину секвенируемых фрагментов;
• оптимизировать эксперимент для максимальной производительности;
• проводить таргетное секвенирование.

Особенности набора:

время пробоподготовки	от 60 минут + ПЦР
требуемое количество ДНК	до 100 нг геномной ДНК
необходимость ПЦР	да
фрагментация ДНК	опциональная
длина рида	зависит от длины ампликона
производительность	3 гигабазы и более за 6 часов, 8 гигабаз и более за 48 часов
совместимые протоколы	PCR Sequencing
	Four Primer (Nested) PCR Sequencing*
мультиплексирование	до 12 образцов, с PCR Barcoding Kit
количество библиотек	6

* Полные протоколы доступны на сайтеwww.nanoporetech.com для зарегистрированных пользователей-участников Nanopore Community.

Пробоподготовка заключается в опциональной фрагментации ДНК с последующей достройкой концов до тупых и присоединением 3’-dA. К 3’-dA лигируются олигонуклеотиды, содержащие сайты связывания ПЦР-праймеров. ДНК амплифицируется, и к ампликонам присоединяются сиквенсные адаптеры.

Стадия ПЦР зависит от исходного количества ДНК и желаемой длины ампликонов. Рекомендуемый протокол ПЦР рассчитан на 100 нг исходной ДНК.

Длина рида составляет в среднем около 2 килобаз и зависит не столько от процессивности Taq-полимеразы, сколько от особенностей пробоподготовки. Но при этом максимальная длина рида выше, чем при использовании набора Rapid PCR Barcoding Kit и может достигать 10 килобаз.

Пользователь также может использовать метод ПЦР с 2 парами праймеров (nested PCR); при этом одна пара праймеров — пользовательские праймеры к определённой последовательности ДНК, а вторая — бар-кодированные праймеры из набора. 5’-концы пользовательских праймеров должны быть комплементарны 3’-концам бар-кодированных праймеров.

Набор позволяет работать с ДНК, содержащей примеси, которые снижают эффективность получения библиотеки. Это происходит благодаря стадии ПЦР. Но необходимо учитывать, что амплификация разных фрагментов может идти с разной эффективностью.

Если исходное количество ДНК менее 1 пг, рекомендуется полногеномная амплификация.

В состав PCR Sequencing Kit также входит набор Flow Cell Priming Kit для загрузки библиотеки в поточную ячейку.

Условия хранения: -20 °С.

Дополнительные расходные материалы и реактивы:

• магнитные частицы Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter);
• набор для достройки концов ДНК NEBNext End repair / dA-tailing Module (New England Biolabs E7546);
• ДНК-лигаза NEB Blunt/TA Ligase Master Mix (New England Biolabs M0367);
• 1,5 мл пробирки типа Эппендорф с низкой адгезивностью DNA LoBind (Eppendorf 30108051);
• 0,2 мл тонкостенные пробирки для ПЦР (Thermo FS AB0620);
• вода, не содержащая нуклеаз (Thermo FS R0581);
• мастер-микс для ПЦР LongAmp Taq 2X (New England Biolabs M0287);
• свежеприготовленный 70% этанол;
• буферный раствор Tрис-HCl 10 мМ рН 8.0 с 50 мМ NaCl.

Опционально:

• экзонуклеаза I (New England Biolabs M0293);
• пробирки для фрагментации ДНК Covaris g-TUBE.

Дополнительное оборудование:

• настольная микроцентрифуга (например, Eppendorf 5452000018);
• вортекс (например, Biosan BS-010203-AAG);
• магнитный штатив (Диаэм 3336);
• ротационный перемешиватель (например, Elmi RM1L);
• амплификатор;
• набор автоматических пипеток переменного объёма — от 0,5 до 10 мкл (например, Eppendorf 3120000020), от 2 до 20 мкл (например, Eppendorf 3120000038), от 10 до 100 мкл (например, Eppendorf 3120000046), от 20 до 200 мкл (например, Eppendorf 3120000054) и от 100 до 1000 мкл (например, Eppendorf 3120000062);
• наконечники с фильтром к автоматическим пипеткам;
• таймер (например, TR118OS).

Опционально:

• флуориметр Qubit (Thermo FS Q33227) или аналогичный;
• система для фрагментного анализа (например, Qsep 100);
• наноспектрофотометр (например, NanoDrop 2000C).